ВИЗНАЧЕННЯ ТОЧКОВИХ МУТАЦІЙ В МІТОХОНДРІАЛЬНІЙ ДНК З ВИКОРИСТАННЯМ МЕТОДУ ПЛР І РЕСТРИКЦІЙНОГО АНАЛІЗУ

УДК: 575.224:577.213/.215:57.008.7

 

Гусар В.А.1, Гречаніна Ю.Б.2, Жаданов С.І.3, Шурр Т.3,

Гречаніна О.Я.2, Фадєєва А.Л. 2

Спеціалізований медико-генетичний центр1, Харків, Україна

Інститут клінічної генетики ХНМУ2, Харків,Україна

Департамент антропології Університету Пенсільванії3, Філадельфія, США

 

 

Точні методи лабораторної діагностики мітохондріальних захворювань (МЗ) стали доступні тільки після повного секвенування мітохондріального генома, яке було завершене на 20 років раніше ядерного (1981р.), а також після розробки методу полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) та методу рестрикції. Разом з тим генетичні причини виникнення ряду мітохондріальних синдромів були знайдені трохи більше 20 років тому [6,9,27], хоча деякі з синдромів були описані задовго до цих відкриттів (синдром Лебера - 1871 р. [11], синдром Лея - 1951 р. [12], синдром Кернса-Сейра - 1958 р. [10] та ін.). На сьогоднішній день встановлено, що мутації в мітохондріальній ДНК (мтДНК) відбуваються в 5 разів частіше, ніж в ядерній ДНК. Відомо більш 150 патогенних точкових мутацій і більш 100 крупних реорганізацій молекул мтДНК [7]. У зв'язку з тим, що однією з основних функцій мітохондрій в організмі людини є енергетична функція, при мітохондріальній патології, в першу чергу, вражаються тканини і органи, які споживають велику кількість енергії – мозок, серце, скелетна мускулатура, сітківка ока, ниркові канальці, ендокринні залози [1,18]. Це обумовлює і головні ознаки мітохондріальної патології – мультисистемність, прогресуючий характер захворювання. Проте патологічні стани органів при мітохондріопатіях не є специфічними, вони можуть бути обумовлені і іншими захворюваннями [1- 3]. Діагностика МЗ тільки на підставі клінічної картини недостатня, для точної діагностики потрібне проведення сучасних досліджень - МРТ головного мозку, електроміографії, цитологічних досліджень біоптатів тканин, іммуногістохімічних досліджень цитохромоксидази, сукцинатдегідрогенази, НАДН, АТФ-ази та ін., а також вимірювання активності окремих мітохондріальних ферментів та їх комплексів в гомогенатах м'язів, дослідження електронно-мікроскопічними методами структури мітохондрій, дослідження полярографічними методами поглинання кисню ізольованими мітохондріями, вимірювання рівня лактату в плазмі крові та спинномозковій рідині (СМР) та неінвазивне вимірювання рівня лактату в головному мозку і СМР сучасними методами МРТ класичних біохімічних показників [2,3]. Підтверджуюча діагностика мітохондріальної патології за допомогою методів молекулярної діагностики набуває особливої актуальності. Молекулярне дослідження повинне бути спрямованим на клінічний фенотип. Багатодисциплінарний підхід вкрай необхідний для уточнюючої діагностики МЗ, бо пацієнтів не завжди можливо зразу віднести до одного із клінічно визначених синдромів. Пошук мутацій спеціалістами молекулярної діагностики потребує знання клінічного діагнозу. На підставі пошуку точкових мутацій мтДНК у 32 пацієнтів із певними клінічно визначеними МЗ, ми доводимо складність уточнюючої молекулярної діагностики і її високу діагностичну ефективність. Наводиться описана вперше в Україні 2 мутація 12706С ND5 мтДНК, асоційована із синдромом Лея (Leigh syndrome). Метою дослідження був пошук точкових мутацій у мітохондріальному геному пацієнтів із клінічно встановленим діагнозом МЗ. Матеріали і методи. В обстеженій групі з 32 пацієнтів з підозрою на мітохондріальну патологію була проведена комплексна: клінічна, біохімічна і молекулярна діагностика. Така кількість пацієнтів була відібрана із 182 обстежених з підозрою на МЗ на підставі наявності у них клінічно встановлених нозологічних форм МЗ. Спектр досліджених мутацій визначався клінічними формами і частотою певних мутацій. Молекулярне дослідження біологічних зразків пацієнтів виконувалось в Департаменті антропології Університету Пенсільванії (Prof. Т.G.Schurr, Ph.D., MD. S.I.Zhadanov, Філадельфія, США), в лабораторії цитоплазматичної спадковості Інституту генетики і цитології НАН Білорусі (проф. Н.Г.Даниленко), в лабораторії молекулярної діагностики ХСМГЦ (к.мед.н. В.А.Гусар, м.н.с. А.Л.Фадєєва).

 

В якості біологічного матеріалу використовувалася ДНК, виділена з лейкоцитів периферичної крові. Виділення ДНК проводили з використанням тестсистеми НПФ «ЛІТЕХ», а також фенолхлороформною екстракцією. Для виявлення мутацій мтДНК застосовували метод ПЛР з подальшою рестрикцією. Ампліфікацію проводили у відповідності до протоколів дослідження. Рестрикційний аналіз проводили з використанням наступних рестриктаз: HAE III, Msp1, Bgl1 (НПО «Ферментас»). Результати детектували у агарозному (2-3%) та акриламідному гелях. Делеції в мтДНК досліджували двома методами: методом Long PCR і методом із застосуванням трьох праймерів, який був розроблений в лабораторії цитоплазматичної спадковості Інституту генетики і цитології НАН Білорусі. Для long PCR використовувалися два специфічних праймера з послідовностями, гомологічними ділянкам за межами делеції (F і R) (рис. 1а). В результаті застосування даної методики у разі відсутності делеції синтезується фрагмент мтДНК завдовжки 10,2 т.п.н., а за наявності тієї або іншої делеції синтезуються фрагменти меншого розміру.

 

Методика із застосуванням трьох праймерів дозволяє виявляти найбільш поширену делецію (виявляється ~ у 30 % пацієнтів, які страждають на синдром Кернса-Сейра): послідовність прямого праймера (F) гомологічна ділянці за межами делеції, послідовність одного зворотного праймера (R1) – гомологічна стрічній ділянці за межами делеції, а послідовність другого зворотного праймера (R2) гомологічна ділянці делеції (рис.1б). Умови ампліфікації були підібрані таким чином, що довга ділянка FR1 не синтезувалася. В результаті, за відсутності делеції синтезуються два фрагменти ДНК – FR1 (короткий, без синтезу ділянки можливої делеції) і FR2, а за наявності делеції – тільки один фрагмент FR1.

 

Молекулярно-генетичне дослідження мутацій (делецій) на синдром КернсаСейра, синдром Пірсона і синдром прогресуючої зовнішньої офтальмоплегії проведене з використанням методу Long PCR. Дослідження зразків на наявність делецій мтДНК не виявило результатів, оскільки реакція ампліфікації не пройшла (рис. 8). Це може бути зв'язано з тим, що виділення ДНК з використанням тестсистем не завжди забезпечує вихід ДНК належної якості, або з тим, що якість ДНК знизилася в результаті тривалого зберігання.

 

Дослідження окремих точкових мутацій мтДНК, асоційованих із синдромами MERRF, MELAS, синдромом Кернса-Сейра, Пірсона та синдромом прогресуючої зовнішньої офтальмоплегії не дали позитивних знахідок, тому результати подальшого вивчення будуть надані в інших публікаціях. З 2002 року в рамках спільного проекту «Всебічний аналіз епідеміології та механізмів експресії мітохондріальних хвороб у слов'янських популяціях східної України» з лабораторією молекулярної генетики й генетики розвитку людини при Інституті цитології й генетики Сибірського відділення РАН (м.Новосибірськ, Росія) і Департаментом антропології Університету Пенсільванії (м.Філадельфія, США) проведений детальний скринінг патогенних мутацій мтДНК і дослідження стану енергетичного обміну у обстежених хворих. Мітохондріальна NADH-Хінон оксідоредуктаза (комплекс І дихального ланцюга; ЕС 1.6.99.3) - один з більших і найбільш складних міжмембранних ферментних комплексів. Цей фермент каталізує перенос електронів від NАDН до убіхінону й переміщає протони з мітохондріального матрикса в міжмембраний простір. Потік електронів і протонів створює електрохімічний градієнт на внутрішній стороні мітохондріальної мембрани, що забезпечує функціонування протонного насоса, який використовується при синтезі АТФ. Комплекс І складається, принаймні, з 43 різних субодиниць, сім з яких кодуються мтДНК (позначуваних ND1-6 і 4L), а інші - ядерною ДНК. Однак, скоординовані взаємодії між ядерним геномом і мітохондріальним, які забезпечують роботу цього життєво-необхідного комплексу протеїнів, залишаються до кінця не вивченими. Спостереження над мітохондріальною патологією свідчить про значну питому вагу нейродегенеративних захворювань серед мітохондріопатій. Серед причин нейродегенеративних захворювань мітохондріального ґенезу дефіцит комплексу І дихального ланцюга був описаний у випадках нейродегенеративних розладів із пізньою маніфестацією, таких як хвороба Паркінсона, а також при важких неврологічних станах у немовлят і дітей грудного віку, що частіш за все проявляються синдромом Лея. За свідченням Liolitsa D. et.al [13] у пацієнтів із синдромом Лея зустрічаються різні ядерні генні дефекти і мутації мтДНК. Частіше за все – це мутації у мтДНК, які відбуваються в гені ND5, що, на думку авторів, дозволяє вважати ген ND5 «гарячою точкою» при мітохондріопатіях. Більшість таких мутацій описані як унікальні генетичні дефекти з неоднозначними патогенетичними ролями, оскільки не була доведена їхня асоціація з фенотипом синдрому Лея. Механізми експресії описаних мутацій все ще залишаються нез’ясованими. A.MorganHughes J.A., Hanna M.G. [16] описали мітохондріальні енцефаломіопатії та припустили, що додатковими механізмами, які визначають фенотипічну експресію, можуть бути генетичний фон і екологічний фактор. Наше спостереження (хвора Г.), яке наводиться, є випадком виникнення de novo гетероплазмічної мутації 12706С ND5 у хворої, у якої клінічно маніфестував фатальний синдром Лея з незвичайним симптоматичним ушкодженням і асиметрією головного мозку. Раніше мутація 12706С була описана як причина істотного зменшення активності комплексу І у пацієнтів із Лея-подібним синдромом [20] і припущення її ролі у розвитку ідіопатичної хвороби Паркінсона. Між іншим, ще в 1996 Miller і Kelly підтвердили асоціацію гіпергомоцистеінемії із хворобою Паркінсона, але на це не звернули увагу дослідники в подальшому. Проведений філогенетичний аналіз позитивних випадків з мутацією 12706С, який продемонстрував, що всі мутації відбулися при різних гаплогрупах мтДНК шляхом незалежних мутаційних подій. Даний аспект мутації 12706С підтверджує її патогенетичне значення в розвитку синдрому Лея і вказує на її істотну роль 7 при нейродегенеративних захворюваннях у різних родинах. Ми розглянули «злоякісні» мутації гена ND5 мтДНК і припустили, що деякі з них можуть мати загальні механізми експресії, які зачіпають функціонально важливі аспекти.

 

Молекулярно-генетичні дослідження. Із зразків крові пробанда і її матері була виділена тотальна геномна ДНК. ДНК, виділена з м'язової тканини в позитивному випадку з мутацією 12706С (випадок пробанда F.), описаному раніше, була люб'язно надана нам доктором А.Munnich и S. Lebon, для проведення порівняльного аналізу. МтДНК аналізувалася за допомогою саузерн-блотт гібридизації, з наступною рестрикцією ферментами SnaBI и PvuII, для виключення мутацій/перебудов мтДНК, що часто зустрічаються. Регіон, що кодує мтДНК, був ампліфікований зі специфічним набором праймерів на ділянки, що перекриваються, розміром 3 - 4 Кб в обох пробандів. Обидва зразки були секвеновані з використанням BigDye Terminator Pre-Mix kits, v3.1 (Applied Biosystems), очищені з використанням Centri-Sep columns (Princeton Separations) і розігнані на секвенаторі ABI 3100 Gene Analyzers у Центрі Секвенування відділу генетики Університету Пенсільванії. Сиквенсові файли були впорядковані з використанням програми Sequencher 3.1 (GeneCodes Corp.) і рівнялися зі стандартною Кембриджською послідовністю (Cambridge Reference Sequence, CRS). Наявність мутації 12706С ми підтверджували, використовуючи метод мутаційно-специфічної рестрикції з ферментом BsaXI з наступної ПЛРампліфікацією фрагмента 460 п.н. (позиції 12385-12845 т.п.н.). Крім того, був проведений скрінінг на мутацію ND5 серед 187 здорових осіб і пацієнтів з мітохондріальною хворобою, що підходять по гаплогрупам, обраних серед учасників з інших біомедичних проектів. Кількісне визначення рівня ДНК. Кількість мутантної мтДНК у зразках крові і м'язової тканини визначали, використовуючи рестрикційний аналіз із надлишком ферменту BsaXI. Провели розподіл зразків в агарозному гелі та проаналізували шляхом лазерної денситометрії після фарбування етидіумом броміду. Рівень гетероплазмії був оцінений по фактичній піксельній інтенсивності різних фрагментів мтДНК у гелі [14]. Вторинна структура білка і молекулярне моделювання. Вторинна структура білка ND5 була проаналізована за допомогою комп'ютерної програми Proteomics ExPASy на сервері http://us.expasy.org/cgibin/protscale.pl). Упорядкування структури зразка дикого типу ND5, також як і мутантного зразка, було виконано з використанням TMpred Рrogram, що доступна через сервер Швейцарського інституту (група біоінформатики) (), а застосування KyteDoolittle використане для аналізу гідропатії. Всі гідропатії як для білка дикого типу, так і для мутантного білка, були обчислені при розмірі рамки 9. У цілому з GenBank були взяті 974 амінокислотні послідовності і упорядковані з використанням CLUSTAL W, відповідно до протоколу UniProtKB (http://www.ebi.uniprot.org). Послідовності ND5/NuoL/MnhA, відібрані для упорядкування, включали наступні послідовності: Homo sapiens ND5 (P03915), Bos taurus (P03920), Gallus gallus (P18940), Xenopus laevis (P03922), Salmo salar (Q9ZZM3), Brachydanio rerio (Q9MIY0), Strongylocentrotus purpuratus (P15552), Drosophila melanogaster (P18932), Triticum aestivum (Q37680), Neurospora crassa (P05510), Rhodobacter capsulatus (RRC00609). Метод РHD був 9 використаний для визначення вторинної структури (). Визначення PSI-BLAST ND5 області (домена) проводилося з використанням великої бази даних (nrdb90), включаючи послідовності з Pfam-A, інформація про які доступна на сервері The DomPred Protein Domain Prediction (). Філогенетичний аналіз. Данні секвенування мтДНК родин пробандів і контрольних осіб при проведенні популяційного дослідження були проаналізовані за допомогою філогенетичного аналізу NETWORK [4], щоб визначити еволюційні відносини між гаплотипами, що мають мутацію 12706С. Філогенетична мережа спочатку була побудована з використанням серединного алгоритму (reduced-median algorithm) [4] і потім змінена вручну. Клінічний профіль. Більшість мутацій ND5 часто призводять до розвитку різних нейродегенеративних синдромів з варіабельністю клінічних ознак [5,13], що вказує на залучення систем органів при наявності декількох генетичних дефектів. Коркова атрофія гемісфер, залучення базальних гангліїв, часте ушкодження стовбура мозку з відсутністю життєвих рефлексів, ділятаційна кардіоміопатія неодноразово спостерігалися при синдромі Лея [12, 17, 21] і з'явилися підставою для постановки діагнозу у випадку, описаному нами. Початкова маніфестація синдрому Лея із симпатичним кризом впливає на ушкодження таламічних ядер і входить у список патогенних форм "діенцефальної епілепсії", розширюючи клінічну гетерогенність цього синдрому. З іншого боку, спостережувана автономна відповідь може бути наслідком раніше існуючого гідроцефального стану. Синдроми серцевих аритмій досить часто спостерігаються серед пацієнтів з мітохондріальними порушеннями [19,30], також часто відзначаються у пацієнтів, обтяжених мутацією ND5 мтДНК [25]. Ці спостереження припускають, що мутації мтДНК і порушений енергетичний метаболізм відіграють схильну роль у розвитку аритмій. Генетичний і філогенетичний аналізи. Секвенування регіону, що кодує, мтДНК пробанда Г. виявило 24 основні нуклеотидні заміни в порівнянні з СRS (табл.3). МтДНК пробанда мала поліморфні сайти, які характерні для гаплогрупи Х2е. Ця лінія мтДНК бере початок у Південній Сибірі, і також часто спостерігається у жителів Кавказу [22]. Тільки мутація мтДНК у пробанда Г. транзиція Т→С у позиції 12706, привела до заміни на рівні трансляції 124-ого ароматичного залишку фенілаланіну на аліфатичний лейцин, що розташований у трансмембранній спіралі, знайдені за допомогою методу РHD.

 

Було також проскриновано 200 здорових осіб (КГ) і пацієнтів з мітохондріопатією, що мають гаплогрупи Н і X, з нашої бази даних на мутацію 12706С, але вона не була виявлена (дані не наведені). Крім того, нами не було знайдено даних по мутації 12706С ND5 у великій базі даних, що містить повну інформацію про більш ніж 2 400 нуклеотидних послідовностях мтДНК (mtDB ) . Генетичні заміни, що могли, можливо потенційно змінити кодон F124, також не були знайдені. Патогенетичні механізми мутації ND5. Хоча периферичний, NАDНфрагмент комплексу I, що окисляє, був досить інтенсивно вивчений, роль мембранної області (домена), що кодує мтДНК, до кінця не з'ясована. Фізіологічна важливість субодиниці ND5 очевидна зі спостережень, що активність комплексу І повністю регулюється експресією гена ND5, а субодиниця ND5 відіграє істотну роль в активації комплексу І. Огляд наявних даних свідчить про те, що ген ND5 мутує, в основному, з більш десятьма замінами в мтДНК, які описані в асоціації з мітохондріальними цитопатіями. Залучення периферичної і центральної нервової системи, яке часто спостерігається при синдромі Лея [25] і його сполученому варіанті синдром Лея/МЕLAS [5] припускає існування загальних механізмів експресії дефектів ND5. Ми провели вивчення вторинної структури субодиниці ND5 і проаналізували її передбачувані функціональні ділянки, у яких могли виникнути патогенні мутації, щоб пояснити механізми їхньої експресії. Використовуючи метод РНD, ми показали, що поліпептид ND5 охоплює, принаймні, 12 трансмембранних петель, тісно з'єднаних із внутрішньою мембраною мітохондрії (дані не наведені). Визначення PSI-BLAST області (домена) далі показало, що ND5 складається із трьох головних функціональних доменів (число PSIBLAST = 1000), перший, з яких, локалізований в III трансмембранній спіралі білка (рис.13). Цей регіон специфічно зачіпає мутація F124L в ND5, що проявляється важкими нейродегенеративними змінами у пацієнтів із синдромом Лея, а також пов'язана з різними дефектами в Е145G при синдромі Лея [13]. 

 

Центральний фрагмент субодиниці ND5 людини, що охоплює трансмембранну петлю III і VIII, вказує на високу подібність до Na+ /H+ , як найбільш консервативна область серед різних зразків (рис. 10, див. також дані NuoL в [24]). Високий ступінь подібності гомологів ND5 (Ngo12/NuoL) і субодиниці А багатокомпонентного катіона/Н+, привела до припущення, що ND5 забезпечує протонний канал у комплексі І [8]. Група Tsuchiya висунула гіпотезу, що амінокислотна послідовність VFF - один з варіантів білка, що може бути залучений у зв'язування Na+ , і ймовірно, відіграє помітну роль у протонному інгібуванні амілорідом ND5 бика. В ND5 людини амінокислотна послідовність VFF відсутня, але знайдена послідовність, що має, принаймні, три FF-сайти (Q116FF, A333FF, и S590FF). Із цих трьох, сайт Q116FF розташований в області, суміжній із трансмембранною петлею III і вище залишку Е124, у якому перебуває мутація 12706С (рис. 10). Експериментальні дані далі демонструють, що DССD (N,N'- dicyclohexylcarbodiimide) інгібірує перенос електронів і Н+ у комплекс І. Цей процес інгібірування, як вважають, є наслідком специфічної блокади високо консервативного карбоксільного залишку, що бере участь у протонному транспорті. Варто вказати на те, що ця ділянка також перебуває в трансмембранній спіралі III субодиниці ND5 і входить до складу карбоксільного залишку Е145 (ND5 бика/ ND5 людини) [28]. У пацієнтів із синдромом Лея Е145 заміщений на G [13]. Далі було відзначено, що сайт Е145 розташований у межах еволюційно високо консервативної області GWEGVGI, що є головною поєднуючою для NАD(Р)Н і FАD, [GХGХХG], у ротенон-нечутливої бактеріальної NADН (NDН-2) дегідрогенази 2 типу (рис. 10). Зовсім недавно область ND5 у межах спиралі III була описана як повна гетероплазмічна мутація мтДНК у тканині мозку пацієнтів із хворобою Паркінсона, і є одним з можливих факторів, що впливає на патогенетичний механізм ідіопатичної хвороби Паркінсона [20]. Найбільш специфічно те, що мутації F124L і Е145G при синдромі Лея є найпоширенішими в таких тканинах, і, вочевидь, є причиною системного дефекту комплексу І у пацієнтів із хворобою Паркінсона [23, 29]. Крім того, паркінсонізм може бути пов'язаний не тільки з ідіопатичними випадками хвороби Паркінсона, а й виникати, як високо гетерогенний стан із залученням генетичних і екологічних етіологічних факторів. Повідомлялося, що хронічний і системний вплив токсичного пестициду ротенона відтворює особливості клініки хвороби Паркінсона в експериментальних моделях. Хоча точний 14 механізм токсичного ефекту ротенона складний і залишається, при впливі in vitro, у значній мірі неясним, він може впливати на каталітичну ділянку, що відповідальна за відновлення убіхінону до дігідроубіхінона на останній стадії переносу електронів у комплексі І. Дослідження фотоафінністі аналога фенпіроксимата і структур рентгеном припускають, що можливий інгібітор Q перебуває в межах комплексу І, що може містити ND5 поряд з безліччю інших субодиниць. Виходячи із цього, ми висунули гіпотезу про те, що мутації F124L і Е145G ND5 змінюють функціонально важливі сайти, які потенційно залучені в механізм переносу протонів, і це порушення являє собою первинний патогенетичний механізм експресії. Часте виникнення патологічних мутацій у трансмембранній петлі III підтримує ідею про те, що таке місце розташування впливає на функцію або структуру протонного каналу комплексу І. Таким чином, навіть малий мутаційний вантаж (менш 50% мутантної мтДНК при 12706С і 12770А) може значно впливати на його функцію. Якщо ND5 також залучений у патогенез ідіопатичної хвороби Паркінсона, вищевказаний механізм міг би пояснити мітохондріальну дисфункцію у пацієнтів із хворобою Паркінсона і зв'язок між різними нейродегенеративними синдромами, такими як, синдром Лея і хвороба Паркінсона. Висновки. У цілому, знайдена нами мутація 12706С ND5 відповідає всім критеріям, по яких її можна вважати патологічною і є більш частою генетичною причиною нейродегенерації, ніж вважалося раніше. Саме з цієї причини, вона повинна бути включена в рутинний скринінг пацієнтів з мітохондріальними цитопатіями. Фенотипічна експресія мутації 12706С - це типові ознаки клінічної картини при синдромі Лея. У стані гетероплазмії (мутантний поріг ~ 30- 50%) мутація також присутня в різних тканинах, що чітко вказує на низький генетичний поріг для фенотипічної експресії. Фактично, ця мутація неодноразово виникала, як мутаційна подія de novo, при різних генетичних фонах (backgrounds), кожний з яких був асоційований з фенотипами синдрому Лея. Її виникнення de novo повна відсутність у здорових осіб, надалі, припускає, що вона швидко усувається з популяції шляхом негативної селекції. Крім того, мутація 12706С перетворює еволюційно високо консервативний ароматичний фенілаланін у лейцин і асоціює з істотним зменшенням активності комплексу І. Ми припускаємо, що вона торкається функціонально значимої трансмембранної області, що, імовірно, є відповідальною за функцію переносу протонів комплексу І і може мати механізми експресії, подібні з такими, при ідіопатичній хворобі Паркінсона. Таким чином, колективу дослідників в рамках колабораторного дослідження вдалося уточнити діагноз у випадку виникнення de novo в одного з пацієнтів гетероплазмічної мутації 12706С ND5, асоційованої із клінічним проявом фатального синдрому Лея. Проведений філогенетичний аналіз позитивних випадків з мутацією 12706С підтвердив незалежне виникнення таких мутацій, кожна з яких була наслідком нової мутаційної події в різних мтДНК. Дослідження виконані за підтримкою Fight for Sight Grant-in-Aid і Faculty Research Funds Університету Пенсільванії.

 

В настоящей статье представлены данные о поиске точковых мутаций мтДНК при синдроме Лея, Кернса – Сейра, Пирсона, NARP, MERRF, MELAS с использованием метода ПЦР и рестрикционного анализа. На основе поиска точковых мутаций мтДНК у 32 пациентов с клинически установленными митохондриальными заболеваниями, мы приводим сложность уточняющей молекулярной диагностики и ее высокую диагностическую эффективность. Приведен случай возникновения, описанной впервые в Украине, гетероплазмической мутации de novo 12706С ND5 мтДНК, ассоцированной с клиническим проявлением фатального синдрома Лея (Leigh syndrome). Приведенные данные подчеркивают важность включения секвенирования гена ND5 в диагностический протокол при митохондриальных цитопатиях.

We presented in the article search-based data of mtDNA point mutations in Leigh syndrome, Kearns–Sayre syndrome, Pearson syndrome, NARP, MERRF, MELAS using PCR and restriction analysis. We presented the complexity of clarification of molecular diagnostics and its high diagnostic efficiency on search-based of mtDNA point mutations in 32 patients with clinically relevant mitochondrial diseases. We present an event of heteroplasmic mutation de novo 12706S ND5 mtDNA that associates with clinical manifestation of a fatal Leigh syndrome and was described for the first time in Ukraine. The above data underline the importance of including the sequencing of ND5 gene in diagnostic protocol for mitochondrial cytopathies.